科学网—做实验抗体不起作用怎么办！
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2024-11-6 20:42
| 系统分类: 海外观察
卡尔 · 拉弗拉姆知道他想研究的蛋白质，但不知道在哪里可以找到它。这种蛋白质由一种名为 C9ORF72 的基因编码，该基因在一些患有毁灭性神经系统疾病 — 运动神经元病（也称为肌萎缩侧索硬化症）的人中发生了突变。拉弗拉姆希望了解它在这种疾病中的作用。
当他在加拿大蒙特利尔神经病学研究所 - 医院开始他的博士后研究时，拉弗拉姆查阅了大量文献，寻找有关这种蛋白质的信息。问题在于，所有论文似乎都对这个神秘分子在细胞中的运作位置没有一致的看法。 “ 这个领域存在很多混乱， ” 拉弗拉姆说。
他想知道是否应该归咎于某种试剂，特别是科学家们用来测量蛋白质量并追踪其在细胞中的位置的抗体。因此，他和同事们决定测试市面上可用的抗体。他们确定了 16 种商业抗体，这些抗体被宣传为能够结合到 C9ORF72 编码的蛋白质上。当研究人员对它们进行测试时，只有三种表现良好 —— 意味着这些抗体能与感兴趣的蛋白质结合，而不与其他分子结合。但是没有一个发表的研究使用了这些抗体。大约 15 篇论文描述了使用一种甚至没有在拉弗拉姆的测试中结合关键蛋白的抗体的实验。而这些论文共被引用了 3000 多次。
拉弗拉姆的经历并不罕见。科学家早就知道，许多商业抗体并没有像它们应该那样工作 —— 它们通常无法识别特定的蛋白质或非选择性地结合到几个其他目标上。这导致了时间和资源的浪费，一些人说这导致了生物科学中的 “ 可重复性危机 ” ，可能会减缓发现和药物开发的步伐。
拉弗拉姆是一个日益增长的社区的一部分，这个社区想要解决研究中不可靠的抗体问题。他与多伦多大学的分子遗传学家阿莱德 · 爱德华兹合作，成立了通过开放科学表征抗体（ YCharOS ，发音为 “ 伊卡洛斯 ” ）的倡议，旨在为每个人类蛋白表征市售的研究抗体。
还有努力在进行中，以生产性能更好的抗体，使研究人员更容易找到它们，并鼓励研究社区在选择和使用这些分子时采用最佳实践。抗体供应商、资金机构和科学出版商都在参与这一行动，英国莱斯特大学的医师 - 科学家哈文德尔 · 维尔克说。 “ 很难想象一个已经持续了这么久的问题会突然改变 —— 但我希望如此。 ”
检验抗体
免疫系统对外来物质（如病毒和细菌）产生抗体，标记它们以便销毁。这使得抗体在实验室实验中非常有用。科学家利用这种能力，使用它们来标记或量化特定的生物分子，如蛋白质的一个片段。为了有效，这些分子标签需要具有特异性 —— 对目标有很强的亲和力 —— 和选择性 —— 能够不标记其他蛋白质的能力。
几十年来，科学家们自己创造这些抗体。他们将蛋白质注射到动物体内，如兔子，其免疫系统会产生针对外来分子的抗体。为了创建一个更长期、更一致的抗体供应，研究人员从动物身上提取免疫细胞，并将它们与不朽化癌细胞结合起来。当试剂公司在 1990 年代开始大规模生产抗体时，大多数研究人员转向从目录购买抗体。如今，市场上大约有 770 万种研究抗体产品，由全球近 350 家抗体供应商销售。
在 2000 年代末，科学家们开始报告许多市售抗体的特异性和选择性存在问题，导致研究人员呼吁成立一个独立机构来认证这些分子是否如广告所述那样工作。多年来，少数团体已经开始评估抗体的努力。
YCharOS 与众不同的是它从销售抗体的公司那里获得的合作关系水平。当拉弗拉姆和爱德华兹着手启动 YCharOS 时，他们联系了能找到的每一个供应商；超过十几家对此表示感兴趣。 YCharOS 的行业合作伙伴提供免费用于测试的抗体。合作伙伴以及该倡议的资助者（包括各种非营利组织和资金机构），在发布前有机会审查特征报告并提供反馈。
YCharOS 通过比较在正常生物学水平表达目标蛋白的细胞系与缺乏该蛋白的所谓敲除细胞系中抗体的特异性来测试抗体（见 “ 验证方法 ” ）。
在去年发表于 eLife 的一项分析中， YCharOS 团队使用这种方法评估了 614 种商业抗体，针对总共 65 种与神经科学相关的蛋白质。其中三分之二的表现不如制造商推荐的那样。
“ 抗体的准确性如何总是让我感到惊讶， ”YCharOS 运营总监里哈姆 · 艾尤比说。 “ 这显示了在工作中包含那个阴性对照是多么重要。 ”
2023 年，抗体制造商重新评估了 YCharOS 标记的性能不佳的一半以上的抗体。他们对其中的 153 个发布了更新的建议，并将 73 个从市场上移除。 YCharOS 团队现已测试了 1000 多种旨在结合到 100 多种人类蛋白上的抗体。
“ 还有很多工作要做， ” 拉弗拉姆说。他估计，在 160 万种商业可用的针对人类蛋白的抗体中，大约有 20 万种是独特的（许多供应商以不同名称销售相同的抗体）。
“ 我认为 YCharOS 倡议真的可以有所作为， ” 斯德哥尔摩 KTH 皇家理工学院的癌症研究员塞西莉亚 · 威廉姆斯说。 “ 但这并不是唯一的事情，因为研究人员会在其他协议中使用这些抗体，以及在其他可能以不同方式表达该蛋白质的组织和细胞中， ” 她说。使用抗体的背景可以改变它们的表现。
其他表征努力正在试图解决这一挑战。安德烈娅 · 拉德特和她的合作者们在成立一个名为人类生物分子地图集计划的细胞图谱联盟时，也建立了器官映射抗体面板（ OMAPs ）。 OMAPs 是社区验证的抗体集合，用于多重成像技术 —— 一种在单个样本中可视化几种蛋白质的技术。与专注于对各种应用中的抗体进行严格表征的 YCharOS 不同， OMAPs 关注的是抗体的一种应用，但在几种不同的背景中，例如在不同的人体组织和成像方法中。为此， OMAPs 招募了来自学术界和工业界的科学家，在自己的实验室中进行验证。
“ 供应商不能测试他们抗体的所有可能应用，但作为一个社区，我们可以说 ‘ 让我们试试这个 ’ ， ” 目前在马里兰州贝塞斯达的仪器公司徕卡微系统担任首席科学家的拉德特说。 “ 人们在测试你永远不会想到能测试的东西。 ”
扩大工具箱
即使有好的抗体，它们也不总是容易找到。 2009 年，加利福尼亚州圣地亚哥的数据共享平台 SciCrunch 的创始人兼首席执行官安妮塔 · 班德罗夫斯基及其同事检查了在期刊文章中识别抗体的难度。在翻阅《神经科学杂志》的论文后，他们发现 90% 引用的抗体缺乏目录编号（供应商用来标记特定产品的代码） —— 这使得它们几乎无法追踪。为了复制一个实验，拥有正确的试剂很重要 —— 而正确的标记对于找到它们是至关重要的，班德罗夫斯基说。
看到其他期刊也存在类似问题后，班德罗夫斯基和她的同事们决定为抗体和其他科学资源创建独特、持久的标识符，如模式生物，他们称之为研究资源标识符或 RRIDs 。如果一家公司停止生产某个产品，目录编号可能会消失 —— 而且由于公司独立创建它们，两个不同的产品可能会最终获得相同的编号。 RRIDs 解决了这个问题。
2014 年，班德罗夫斯基和她的团队启动了一个试点项目，与 25 家期刊合作，要求作者在他们的稿件中包含 RRIDs 。自那以后，超过 1000 家期刊采用了要求这些标识符的政策。 “ 我们目前从论文中有近一百万次对 RRIDs 的引用， ” 班德罗夫斯基说。
最终的希望是，每篇期刊文章的作者都能清楚地用 RRIDs 标记他们使用的资源，如抗体，班德罗夫斯基说。 “ 这本身不会改变可重复性，但这第一步。 ”
除了能够追踪到抗体外，研究人员还需要一种选择使用哪种抗体的方式。 2012 年，当时是英国巴斯大学研究员的安德鲁 · 查默斯共同创立了 CiteAb ，一个帮助研究人员找到最常被引用的抗体的搜索引擎。多年来，该平台已经扩展到包含超过七百万种抗体 —— 现在还包括有关验证的信息，如果有的话。五月份， CiteAb 开始在其网站上整合 YCharOS 的表征数据。
“ 一个大挑战是，抗体在如此多的不同方式中使用，用于如此多的不同物种，你不能简单地判断一个抗体是好是坏， ” 查默斯说。许多人说敲除验证是关键，但在 CiteAb 上，不到 5% 的抗体通过供应商或其他独立倡议（如 YCharOS ）以这种方式进行了验证。 “ 还有很长的路要走， ” 查默斯说。
利益相关者参与进来
像许多其他人一样，维克在一次糟糕的抗体经历后对抗体可靠性产生了兴趣。 2016 年，维克获得了一笔大笔资金来研究一种名为 TRPA1 的蛋白质在气道炎症中的作用。但他的一个同事提到，基于他自己的经验，他正在使用的抗体可能不可靠。
当维克对 TRPA1 抗体进行测试时，他发现他的同事是对的：用于研究 TRPA1 的三种最常引用的抗体中，有两种根本没有检测到人类蛋白，另一种同时检测到了几种其他蛋白。 “ 那真是令人震惊， ” 维克说。 “ 在那个时候，我想离开科学界 —— 因为如果事情真的这么不可靠，还有什么意义呢？ ”
维克没有离开学术界，而是在去年共同创立了 “ 优质抗体 ” （ OGA ）社区，旨在将研究人员、抗体制造商、资助机构和出版商等利益相关者聚集在一起，以解决性能不佳的抗体问题。二月份， OGA 社区举办了首次研讨会，邀请了来自这些不同群体的个人讨论如何提高使用抗体进行研究的可重复性。他们得到了 NC3Rs 的加入，这是一个位于伦敦的科学组织和资金提供者，专注于减少研究中动物的使用。更好的抗体意味着在生产这些分子和使用它们进行实验的过程中使用的动物更少。
目前， OGA 社区正在进行一个项目，帮助研究人员为他们的工作选择合适的抗体，并使他们更容易识别、使用和分享有关抗体质量的数据。它还在莱斯特大学试点一个 YCharOS 站点 —— 这是加拿大以外的第一个，将专注于呼吸科学中使用的抗体。 OGA 社区还在与资助者和出版商合作，寻找奖励研究人员采用抗体相关最佳实践的方法。这种奖励的例子包括为参与抗体验证倡议的科学家提供资金。
制造商也在采取措施提高抗体性能。除了越来越多地自行进行敲除验证外，一些供应商还改变了部分产品的制造方式。
2015 年，当一群超过 100 名科学家在《自然》杂志上发表了一篇评论文章，呼吁社区从由免疫细胞或免疫 - 癌细胞杂交产生的抗体转向所谓的重组抗体时，修改抗体生产实践的需要被提上了日程。重组抗体是在经过基因工程改造的细胞中生产的，这些细胞被编程产生特定的抗体。作者们争论说，专门使用这些抗体将能够无限生产出批次间不变异的抗体 —— 这是旧方法的一个关键问题。
少数制造商正在转向生产更多的重组抗体。例如，位于英国剑桥的抗体供应商 Abcam 已经将其产品组合增加了超过 32,000 种重组抗体。 “ 促进生命科学研究向重组抗体的转变是提高可重复性的关键部分， ”Abcam 新产品开发副总裁汉娜 · 凯布尔说。 “ 这是抗体供应商应该做的事情。 ”
波士顿马萨诸塞州蛋白质创新研究所抗体平台主任罗布 · 迈尔斯表示，这一转变在商业上更有意义。 “ 它们的可重复性要好得多，你可以为它们标准化流程，用户反馈也非常积极， ” 他说。
CiteAb 的数据揭示了过去十年里科学家们在使用抗体方面的行为发生了巨大变化。大约 20% 的涉及抗体的 2023 年论文使用了重组抗体。 “ 这与十年前相比是一个很大的变化， ” 现在担任 CiteAb 首席执行官的查默斯说。
尽管改善抗体可靠性的持续努力朝着正确的方向迈进，但改变科学家的行为仍然是领导这一行动的人面临的最大挑战之一。威廉姆斯说，有些情况下，研究人员不想听到他们用于实验的抗体实际上并没有达到预期效果。 “ 如果有人对某种抗体的结果感到满意，即使确定它不与这种蛋白结合，也会继续使用它， ” 威廉姆斯说。她最终补充说： “ 你永远无法绕过的事实是，研究人员将不得不进行验证。 ”
尽管如此，许多科学家仍希望近期的努力能带来急需的改变。 “ 我对事情正在变得更好持乐观态度， ” 拉德克说。 “ 让我如此鼓舞的是年轻一代的科学家，他们更像是狼群心态，正作为一个社区共同努力解决这个问题。 ”
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