科学网—SSB丨山东大学工程化解脂耶氏酵母细胞工厂从头合成聚（3

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2026-4-15 11:50

| 系统分类: 科研笔记

▲ 工程化解脂耶氏酵母细胞工厂从头合成聚（3-羟基丁酸-co-4-羟基丁酸）（全文共2137字，阅读大约需要7分钟）

近日，山东大学祁庆生教授团队在 Synthetic and Systems Biotechnology 发表了题为“Engineering Yarrowia lipolytica as a yeast cell factory for the de novo production of poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate”的研究论文。

该研究选用琥珀酸脱氢酶缺陷型解脂耶氏酵母作为底盘菌株，采用亚细胞分区策略，使用来源于线粒体的4-羟基丁酸（4HB），在胞质内合成聚（4-羟基丁酸）（P4HB）。进一步引入3-羟基丁酰辅酶A的生物合成途径，首次在解脂耶氏酵母中实现了3-羟基丁酸单体和4HB单体的共聚。通过改变培养基组分，聚（3-羟基丁酸-co-4-羟基丁酸）（P34HB）中4HB单体比例可以由9.17 mol%调整至45.26 mol%。使用5L生物反应器进行分批补料发酵，滴度达到18.61 g/L，占细胞干重（CDW）比例达到19.18%。该研究拓展了酵母细胞工厂合成聚羟基脂肪酸（PHA）时的可用单体库，也证明了解脂耶氏酵母在PHA合成中的潜力。

研究背景

聚羟基脂肪酸（PHA）是一种由微生物合成的生物聚酯，聚（3-羟基丁酸-co-4-羟基丁酸）（P34HB）是由3-羟基丁酸（3HB）单体和4-羟基丁酸（4HB）单体共聚而成的PHA，通过调节4HB单体掺入比例，可以呈现不同柔韧性和拉伸强度的P34HB，在医疗、包装等领域具有巨大的潜力和市场价值。当前P34HB的生物合成主要依赖于细菌平台，存在固有的局限性，如体积生产率低、需要添加相关碳源、基因编辑手段不成熟等，限制了P34HB生物合成的发展。解脂耶氏酵母具有高生物量、代谢通量大、改造手段成熟等优势，是PHA细胞工厂的有力候选者。因此，开发解脂耶氏酵母细胞工厂合成P34HB，对于打破P34HB的生物合成瓶颈具有重要意义。

研究成果

1、4HB单体的合成

该研究首先使用了来源于P. gingivalis的琥珀酸半醛脱氢酶（SucD）和4-羟基丁酸脱氢酶（4Hbd）构建4HB生物合成途径（图1A）。由于线粒体内的琥珀酰CoA是4HB的直接前体，因此分别选择了Po1f以及两株能够高效积累琥珀酸（SA）的琥珀酸脱氢酶（SDH）缺陷型菌株PGC62和PGC91菌株作为出发菌株，并将4HB生物合成途径定位在线粒体中，构建得到的P1、P2、P3菌株分别积累了14.84 mg/L，29.33 mg/L和41.50 mg/L的4HB（图1B）。SDH缺陷型菌株4HB滴度更高，表明了TCA循环的阻断产生较高的琥珀酰辅酶A溢流有利于4HB的合成。

图1 用于4HB和P4HB合成的解脂耶氏酵母工程菌株的构建和优化

2、P4HB生物合成途径的构建

该研究随后选择了来源于P. gingivalis的4-羟基丁酰辅酶A转移酶（Cat2）、N. maritimus的4-羟基丁酰辅酶A合酶（PatZN）和来源于C. necator的PHA合酶（PhaC）来构建P4HB的生物合成途径。由于4HB单体起始合成于线粒体，研究者将Cat2和PatZN依赖的P4HB合成途径分别引入P3菌株的线粒体和细胞质中，构建了P4-P7菌株（图1A），P4HB积累量分别达到386.76 mg/L（2.25% CDW），460.06 mg/L（2.82% CDW），493.62 mg/L（2.95% CDW）和472.33 mg/L（2.81% CDW）（图1C）。不同细胞分区中的合成效率差异归因于辅因子和前体供应：Cat2需要胞质中丰富的乙酰辅酶A，而PatZN则更依赖线粒体中丰富的ATP和游离的CoA。胞质定位的P4HB合成途径更加高效表明了细胞质相比线粒体更有利于胞内产物的积累。通过在P6菌株中进一步增强途径，得到P8菌株，P4HB滴度达到622.78 mg/L（4.74%CDW）（图1C）。

3、3HB单体合成途径的引入

图2 P34HB生物合成途径

该研究进一步通过在P8菌株中表达来源于Streptomyces sp.的乙酰乙酰辅酶A合酶（NphT7）和C. necator的乙酰乙酰辅酶A还原酶（PhaB）引入3-羟基丁酸（3HB）单体的合成途径，得到P9菌株（图2），实现了3HB和4HB单体的共聚。共积累了1.33 g/L（10.14% CDW）的P34HB， 4HB单体比例达到46.94 mol%（图3）。3HB单体的掺入显著提高了PHA的积累而发酵液中检测到的0.64 g/L的3HB，则表明了当前PhaC活性不足。在P9菌株中进一步过表达PhaC，构建得到的P10菌株，P34HB积累提高到了1.60 g/L（11.71% CDW）（图3）。

图3 工程化解脂耶氏酵母发酵P34HB的结果

4、P34HB合成培养基的组分优化

该研究分别选择了丰富培养基（YPD和YPG）和基本培养基（CM1D和CM1G）在摇瓶中测试了P10菌株的P34HB合成情况。结果表明，P10菌株在不同培养基中合成P34HB的滴度和组成存在差异。在YPD，YPG，CM1D和CM1G中分别积累了1.60 g/L（11.71% CDW，45.26 mol% 4HB），1.34 g/L（11.52% CDW，34.46 mol% 4HB），1.57 g/L（16.68% CDW，9.17 mol% 4HB），1.97 g/L（13.68% CDW，15.28 mol% 4HB）的P34HB（图4）。使用YP培养基时4HB单体比例较高，这得益于YP培养基中丰富的营养成分促进了TCA循环，从而推动碳源流向4HB的合成。在CM1培养基中，3HB单体比例和P34HB含量更高，表明CM1可能更有利于将碳源导向脂肪酸的合成，过量的乙酰CoA同时促进了3HB 单体的合成。

图4 摇瓶发酵中不同培养基和底物对P34HB合成的影响

5、5L发酵罐中进行分批补料发酵

使用P10菌株在5L发酵罐中使用CM1D或YPD培养基时，P34HB积累分别达到18.61 g/L（16.70% CDW，29.89 mol% 4HB）和13.34 g/L（19.18% CDW，31.91 mol% 4HB）（图5）。生物量的大幅提升使P34HB滴度分别较摇瓶发酵提高了10.85倍和7.34倍。使用YPD培养基时，TCA循环较强，推动了4HB单体合成，同时脂肪酸合成相对较弱，使更多乙酰辅酶A用于3HB单体的合成，共同促使了较高的P34HB含量；而CM1D则更有利于细胞生长，较高的生物量尽管竞争了更多的碳源，但同时也带来了更高的P34HB滴度，表明平衡细胞生长与P34HB合成是综合提高P34HB积累的关键。而在5L发酵罐中，由于复杂的条件控制，培养基对4HB单体比例的影响被削弱。

图5 在5L发酵罐中对P10菌株分批补料发酵

总结与展望

该研究选择了SDH缺陷型酵母作为从头合成P34HB的底盘，首先将P4HB合成途径分别引入线粒体和细胞质中，实现了P4HB的合成。随后引入3HB单体的生物合成途径，实现了3HB单体和4HB单体的共聚，P34HB滴度达到1.33 g/L。通过增强P34HB合成途径中的关键基因phaC和培养基的优化，进一步增强了工程菌株的P34HB积累。最终在5L发酵罐中，P34HB的最大滴度达到18.61 g/L，占细胞干重含量达到19.18%。该研究证明了酵母作为PHA合成平台的独特潜力，也为酵母PHA细胞工厂的建立提供了重要见解。

原文信息

Engineering Yarrowia lipolytica as a yeast cell factory for the de novo production of poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate)

Jinming Liu, Jia Yan, Zhiyong Cui, Qingsheng Qi

原文链接： https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2405805X25001437

Synthetic and Systems Biotechnology是高质量国际开放获取期刊，创刊2016年。期刊覆盖合成生物学、系统生物学以及生物医药等领域。期刊现已被SCIE、EMBASE、PubMed Central、Scopus、CSCD等重要数据库收录。

2024 Impact Factor: 4.4; 位于Biotechnology & Applied Microbiology领域Q1区

2024 CiteScore: 7.2

位于《2025年中国科学院文献情报中心期刊分区表》生物学大类1区，Top期刊

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主题：解脂耶氏酵母